ГЛАВА 28: НАНОЧАСТИЦЫ ДИОКСИДА ЦЕРИЯ — СЕНСОР НА АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА

Активные формы кислорода (АФК) — это ионы кислорода, свободные радикалы и пероксиды как неорганического, так и органического происхождения [1]. В животных и растительных клетках АФК постоянно образуются в результате цепочки реакций одноэлектронного восстановления кислорода.

Необходимый уровень АФК в организме регулируют ферменты; в случае дисбаланса между образованием и нейтрализацией АФК возникает окислительный стресс. Благодаря развитию нанотехнологий появилась возможность не только регистрировать уровень АФК в клетке, но и управлять окислительным стрессом — например, с помощью наночастиц диоксида церия [2].

Описание задачи

Синтез нанокомпозита на основе СеO₂ для люминесцентного мониторинга наличия АФК — в том числе in vitro. Синтез включает получение золя «голых» наночастиц диоксида церия, без использования стабилизатора, и формирование комплекса наночастица-органический краситель, специфически реагирующего на присутствие АФК.

Реактивы, необходимые для работы

1. Вода дистиллированная.
2. Церия(III) нитрат гексагидрат, Ce(NO₃)₃*6H₂O.
3. Анионообменная смола (например, Amberlite IRA-410 CI).
4. Гидроксид натрия, NaOH, 1 М раствор.
5. Кальцеин (флуорексон) или его динатриевая соль.
6. Пероксид водорода, H₂O₂ 3% раствор.

Оборудование, необходимое для работы

1. Стеклянный стакан объёмом 200 мл — 2 шт.
2. Стеклянный стакан объёмом 50 мл — 1 шт.
3. Стеклянная пробирка или пробирка Эппендорфа — 1-2 шт.
4. Колба объёмом 150 мл с пробкой — 1 шт.
5. Пипетка объёмом 1 мл — 1 шт.
6. Стеклянная палочка — 1 шт.
7. Мерный цилиндр объёмом 200 мл — 1 шт.
8. Весы электронные лабораторные 3-го класса или точнее.
9. Установка для микроволнового синтеза (например, Berghof Speedwave MWS-3) (опционально).
10. Политетрафторэтиленовые автоклавы объёмом 100 мл — 2 шт. (опционально).
11. Сушильный шкаф.
12. Мешок для диализа с размером пор, отвечающим молекулярной массе около 12 кДа (опционально).
13. Культура клеток (опционально).
14. Лакмусовая бумага.

Оборудование, необходимое для анализа (опционально)

1. УФ-лампа «чёрного света» (лампа Вуда).
2. Люминесцентный спектрометр (опционально).
3. Электронный микроскоп (опционально).
4. Люминесцентный биологический микроскоп (опционально).

Описание эксперимента

1. Синтез водного золя, содержащего «голые» наночастицы СеO₂ 

Получение ОН-формы анионообменной смолы. Анионообменную смолу (примерно 20 г) засыпают в стеклянный стакан и заливают 1 М раствором NaOH. Выдерживают 15-20 минут, периодически перемешивая стеклянной палочкой. Сливают раствор щёлочи, смолу многократно промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции по лакмусу.

Синтез. В стеклянный стакан наливают 100 мл дистиллированной воды и растворяют 450 мг нитрата церия. При постоянном перемещивании в стакан добавляют анионообменную смолу в ОН-форме до pH 10. Полученный золь гидроксида церия отделяют от смолы декантацией. Далее термообработку можно провести двумя способами; опциональный вариант, дающий наилучшие результаты, предполагает гидротермальную обработку в микроволновой установке [3]. Для этого полученный pacтвор незамедлительно переносят в политетрафторэтиленовые автоклавы (степень заполнения 50%) и подвергают гидротермально-микроволновой обработке при 130-190°C B течение 30-180 минут. По окончании эксперимента автоклавы извлекают из печи и охлаждают до комнатной температуры на воздухе.

При отсутствии соответствующего оборудования можно проводить термообработку в более мягких условиях. При этом раствор после ионо-обменной обработки немедленно переносят в колбу, плотно закрывают, устанавливают в сушильный шкаф (термостат) при 90-95°C и выдерживают при этой температуре 6-12 часов; по окончании эксперимента колбу извлекают из термостата и охлаждают до комнатной температуры на воздухе. На микрофотографии показаны частицы CeO₂, полученные при экспозиции 8 часов при температуре 95°С.

Получают 100 мл золя диоксида церия с концентрацией 0.01 M.

2. Получение сенсора на АФК

Наночастицы CeO₂ хорошо связывают АФК [2], прежде всего пероксид водорода. При этом с поверхности частиц вытесняются слабосвязанные (адсорбированные) молекулы и ионы. Кальцеин — люминесцентное органическое соединение — образует с поверхностью диоксида церия конъюгат, He обладающий способностью к люминесценции. В результате взаимодействия такого конъюгата с АФК молекулы кальцеина вытесняются с поверхности наночастиц, илюминесценция восстанавливается [4]. 

Навеску 67 мг динатриевой соли кальцеина (~0.1 ммоля) растворяют в 10 мл воды. К 10 мл золя наночастиц диоксида церия, полученного на предыдущем этапе, добавляют 0.1 мл раствора кальцеинa, перемешивают и оставляют стоять в тёмном прохладном месте (опционально: очищают диализом против дистиллированной воды). Полученный оранжевый нелюминесцирующий золь тестируют в реакции с пероксидом водорода. Наливают небольшое количество золя в пробирку (пробирку Эппендорфа) и осматривают при УФ-освещении, затем добавляют к раствору каплю 3% раствора H₂O₂, встряхивают и повторно осматривают при УФ-освещении. Должно наблюдаться различие, как на приведённой фотографии (слева — 10 введения пероксида водорода, справа — после; вверху — при обычном комнатном свете, внизу — при УФ-освещении) [4].

Примечания

Интересно наблюдать появление и исчезновение окраски (от бесцветной, затем светло-жёлтой до тёмно-фиолетовой и снова бесцветной) растворов соединений церия после обработки анионообменной смолой. На этой стадии идёт окисление церия(III) растворённым B воде кислородом; гидроксосоединения церия переменной валентности окрашены.

Дополнительные факты

• Полученный наносенсор можно использовать как при исследовании химических реакций, так и в живых клетках in vitro:

В последнем случае композит способен выполнять ещё одну биологическую функцию — защиты от окислительного стресса и активных форм кислорода. Например, показано, что в присутствии такого композита снижается разрушительное действие на клетку не только пероксида водорода, но и некоторых вирусов [4, 5].

Клетки, обработанные нанокомпозитом НДЦ + кальцеин (левый столбец)

Клетки, обработанные нанокомпозитом НДЦ + кальцеин, а затем H₂O₂ (правый столбец)

• Если для синтеза водного золя, содержащего «голые» наночастицы, использовать смесь солей P33 в определённой пропорции с нитратом церия, то можно получить наночастицы твёрдых растворов Ce_1-xR_xO_2-δ(R = Сd, Nd, Eu, Тb). Например, очень перспективны наночастицы СеO₂, допированного гадолинием. Как известно, ион Gd³⁺ имеет 7 неспаренных электронов и обладает исключительно высоким магнитным моментом (7.94 и µВ), что позволяет использовать гадолинийсодержащие соединения в качестве контрастирующих агентов в магнитно-резонансной томографии (МРТ). Нанокристаллический оксид гадолиния является одним из наиболее перспективных контрастирующих агентов для МРТ, поскольку характеризуется болеевысоким значением констант продольной релаксации по сравнению с координационными соединениями Gd³⁺, используемыми сейчас в медицине. Допирование диоксида церия ионами Gd³⁺ не только позволяет повысить его кислородную нестехиометрию и, следовательно, увеличить антиоксидантную активность, но и обеспечивает возможность визуализации распределения наночастиц Ce_1-x Gd_xO_2-δ в организме [6].

Полезная литература

1. Apel K., Hirt Н. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction // Annual Review of Plant Biology. 2004. V. 55. P. 373-399.

2. Иванов В. К., Щербаков A.B. Баранчиков A.E., Козик B.B. Нанокристаллический диоксид церия: свойства, получение, применение. Томск: Изд-во Томск. yн-тa, 2013. 284 c.

3. Иванов В. К., Полежаева О. С., Щербаков А. Б. и др. Гидротермально-микро-волновой синтез стабильных волей нанокристаллического диоксида церия для биомедицинского применения // Журнал неорганической химии. 2010. Т. 55 (1). С. 3-8.

4. Zholobak N. М., Shcherbakov A.B., Vitukova E.O. et al. Direct monitoring оf the interaction between ROS and cerium dioxide nanoparticles in living cells // RSC Advances. 2014. V. 4 (93). Р. 51703-51710.

5. https://atlasofscience.org/direct-monitoring-of-the-interaction-between-ros-and-cerium-dioxide-nanoparticles-in-living-cells/

6. Гасымова Г. А., Иванова O.C., Баранчиков A.E. и др. Синтез водных золей нанокристаллического диоксида церия, допированного гадолинием // Нано-системы: физика, химия, математика. 2011. Т. 2 (3). С. 113-120.