ГЛАВА 27: НАНОЧАСТИЦЫ ДИОКСИДА ЦЕРИЯ, СНАБЖЁННЫЕ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ МЕТКОЙ

Оксид редкоземельного элемента церия (CeO₂, диоксид церия) в нано-размерном состоянии — чрезвычайно перспективный материал для биомедицинского применения [1, 2]. Наночастицы диоксида церия существенно влияют на протекание редокс-процессов в живой клетке, особенно в условиях окислительного стресса, вызываемого активными формами кислорода. При этом наночастицы диоксида церия имеют низкую токсичность, что обеспечивает сравнительную безопасность их применения in vivo. Собственная люминесценция наночастиц CeO₂ недостаточна для мониторинга их накопления в живой клетке. Поэтому при синтезе золей для биомедицинского применения наночастицы функционализируют люминесцентными метками — например, флуоресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ), фиксируя метку на поверхности наночастицы с помощью полимерных молекул стабилизаторов, в качестве которых могут выступать полисахариды (α-глюканы).

Описание задачи

Получение люминесцентных золей наночастиц CeO₂. Синтез состоит из двух частей: получение нелюминесцентного золя наночастиц диоксида церия, стабилизированного полисахаридами, и функционализация стабилизатора ФИТЦ. (Аналогичный протокол может быть использован для введения люминесцентной метки в золи других наночастиц, стабилизированных полисахаридами.)

Реактивы, необходимые для работы

1. Церия(III) хлорид гептагидрат, CeCl₃*7H₂O.
2. Мальтодекстрин, декстрозный эквивалент DЕ 10-12.
3. Декстран низкомолекулярный или крахмал водорастворимый (опционально).
4. Аммиак водный, NH₄OH.
5. Спирт изопропиловый, (CH₃)₂CHOH.
6. Флуоресцеин-изотиоцианат (ФИТЦ).
7. Пиридин, C₅H₅N.
8. Дилаурат дибутилолова, (CH₃CH₂CH₂CH₂)₂Sn[OCO(CH₂)₁₀CH₃]₂.
9. Диметилсульфоксид (ДМСО), (CH₃)₂SO.
10. Вода дистиллированная.
11.  ФИТЦ-декстран (опционально).
12. Ацетон, CH₃COCH₃ (опционально).

Оборудование, необходимое для работы

1. Стеклянный стакан объёмом 250 мл — 1 шт.
2. Колба с притёртой пробкой объёмом 100 мл — 1 шт.
3. Мерный цилиндр объёмом 200 мл — 1 шт.
4. Стеклянная палочка — 1 шт.
5. Пипетка объёмом 100 мкл — 1 шт.
6. Весы электронные лабораторные 3-го класса или точнее.
7. Магнитная мешалка с нагревом.
8. Центрифуга (опционально).
9. Ультразвуковая ванна (опционально).
10. Сушильный шкаф (опционально).
11. Мешок для диализа с размером пор, отвечающим молекулярной массе около 12 кДа (опционально).
12. Клеточная культура для микроскопии (опционально).

Оборудование, необходимое для анализа (опционально)

1. Спектрофотометр.
2. Люминесцентный биологический микроскоп.
3. Электронный микроскоп.

Описание эксперимента

1. Синтез наночастиц CeO₂, стабилизированных полисахаридами

Синтез проводят по методике, приведённой в статье [3]. В стакан наливают 200 мл дистиллированной воды, растворяют 3.7 г (10 ммоль) гептагидрата хлорида церия(III) и устанавливают стакан на магнитную мешалку. Туда же добавляют 5 г мальтодекстрина (опционально: можно использовать низкомолекулярный декстран или водорастворимый крахмал), перемешивают до полного растворения и удаления пузырьков воздуха и в течение 2-4 часов по каплям добавляют 1 М раствор NH₄OH, поддерживая pH 8-9. Далее реакционную смесь выдерживают при перемешивании в течение нескольких часов, корректируя при необходимости pH. После завершения синтеза рН коллоидного раствора доводят до 12, дополнительно перемешивают раствор в течение 8 часов, затем добавляют к нему 400 мл изопропилового спирта и доводят до кипения. Образовавшийся осадок отделяют декантацией или центрифугированием, несколько раз промывают изопропиловым спиртом, сушат при 60°C до постоянной массы и измельчают. B результате получается сыпучий порошок от белого до кремового цвета, легко растворимый в воде с образованием прозрачного золя наночастиц диоксида церия.

2. Функционализация наночастиц CeO₂, люминесцентной меткой

В колбу с притёртой пробкой помещают 20 мл безводного ДМСО и 0.5 мл пиридина. Засыпают в колбу 3 г порошка, полученного в предыдущем опыте, закрывают плотно пробкой. Устанавливают колбу на магнитную мешалку и перемешивают при 95°С до полного растворения порошка (процесс может занять несколько часов). Опционально: добавляют 20 мкл дилаурата дибутилолова (катализатор реакции изотиоцианатов с гидроксильными группами). Добавляют 100 мг ФИТЦ (во избежание фотообесцвечивания ФИТЦ все дальнейшие манипуляции проводят в стороне от источников яркого освещения) и продолжают перемещивание при нагревании B течение 2-4 часов. Отключают нагрев, охлаждают раствор и добавляют 50 мл изопропилового спирта. Выпавший осадок отделяют декантацией (опционально: лучше воспользоваться центрифугой, 10 000 g в течение 10 минут). При этом непрореагировавший и нe связанный с полисахаридом ФИТЦ растворяется в спирте и может быть отделён. Повторяют промывание 7-8 раз до исчезновения окраски спирта. При этом также вымывается ДМСО: первоначально осадок выглядит как клейкая смолообразная мacca, 10 Mepe отмывания он становится зернистым и хрупким. Отмытый осадок высушивают при 60°С в темноте до постоянной массы и хранят в холодильнике. Опционально: восстановленный ярко-жёлтый (люминесцирующий под воздействием УФ-излучения) золь диоксида церия можно доочистить диализом.

3. Опционально. Полученным золем можно окрасить культуру клеток и исследовать её с помощью люминесцентного микроскопа [4]

Также можно поместить в полученный золь (с концентрацией наночастиц диоксида церия 10-20 мг/л) несколько — ветвистоусых — рачков (дафний), выдержать 1-2 часа, выловить рачков и промыть на сачке, а затем посмотреть при УФ-освещении или под люминесцентным биологическим микроскопом.

Примечания

1. Модификация с использованием ФИТЦ придаёт нейтральным полисахаридам отрицательный заряд, а готовым золям — отрицательный дзета-потенциал. Аналогичный протокол можно использовать для введения родамин-изотиоцианата (РИТЦ) — в этом случае дзета-потенциал золя будет положительным.

2. Для получения люминесцентных наночастиц диоксида церия необязательно использовать протокол функционализации стабилизированных полисахаридами наночастиц с помощью ФИТЦ, если в наличии имеется готовый (коммерческий) реагент ФИТЦ-полисахарид (ФИТЦ-декстран). В этом случае возможны два пути получения люминесцентных наночастиц: в первом случае синтез проводят аналогично описанному, но вместо мальтодекстрина используют ФИТЦ-декстран. Во втором случае используют готовые наночастицы Се0, в виде золей, He содержащих стабилизатора (например, полученные в главе 28 [5]). Для сохранения яркости люминесценции желательно сократить количество манипуляций с ФИТЦ-декстраном, поэтому второй способ предпочтительнее.

Дополнительные факты

Изменяя перед синтезом соотношение церий:мальтодекстрин, можно варьировать размеры наночастиц в получаемом золе; при этом антиоксидантные и цитопротекторные свойства наночастиц тоже будут изменяться [3]. На рисунке приведены микрофотографии наночастиц, полученных при разном соотношении компонентов, и показано их распределение по размеру.

При исследовании биологических объектов с использованием в качестве люминесцентных меток органических красителей остро стоит вопрос разрушения красителя под действием интенсивного облучения УФ-лампой. Для снижения фотодеструкции люминесцентных меток используют энзиматические системы нейтрализации активных форм кислорода (Oxyrase®, OxyFluor™ и T.m). Любопытно, что наночастицы CeO₂ обеспечивают фотопротекторный эффект, превосходящий таковой при использовании — коммерчески доступного энзиматического комплекса OxyFluor™, традиционно применяемого в биологических исследованиях [6]

Полезная литература

1. Иванов В. К., Щербаков А. Б., Баранчиков А. E., Козик В. В. Нанокристаллический диоксид церия: свойства, получение, применение. Томск: Изд-во Томск. ун-та, 2013. 284 с.

2. Иванов В. К., Щербаков А. Б., Жолобак Н. М., Иванова 0. С. Необычные свойства диоксида церия // Природа. 2011. Т. 3. С. 47-57.

3. Щербаков А. Б., Жолобак H.M., Иванов В. K. и др. Синтез и антиоксидантная активность биосовместимых водных золей нанокристаллического диоксида церия, стабилизированных мальтодекстрином // Журнал неорганической химии. 2012. Т. 57 (11). С. 1499-1507.

4. Иванов В. К., Щербаков А. Б., Жолобак Н.М. Щедрый дар Цереры // Химия и жизнь. 2012 (5). С. 14-17.

5. Иванов В. К., Полежаева 0. С., Щербаков A.B. и др. Гидротермально-микроволновой синтез стабильных золей нанокристаллического диоксида церия для биомедицинского применения // Журнал неорганической химии. 2010. Т. 55 (1). С. 3-8.

6. Guha А., Basu А. Role оf rare earth oxide nanoparticles (CeO₂ and La₂O₃) in suppressing the photobleaching of fluorescent organicdyes // Journal of Fluorescence. 2014. М. 24 (3). Р. 683-687.